前置知識

通過病毒介導將核酸導入哺乳動物細胞是一種常用的實驗技術，被廣泛用于基因傳遞、基因表達和功能研究等領域。這個實驗通常分為以下6個部分：

1.選擇適當?shù)牟《据d體：常用的病毒載體包括腺病毒（Adenovirus）、腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）和逆轉錄病毒（Retrovirus）。

2. 構建表達載體：將目標核酸（例如基因、RNA等）插入到病毒載體的適當位點上，構建表達載體。這通常涉及將目標核酸序列克隆到適當?shù)谋磉_載體質粒中，并進行驗證和測序。

3. 病毒包裝和擴增：將構建好的表達載體轉染到特定的包裝細胞中，這些細胞能夠產生具有完整病毒基因組的病毒顆粒。病毒顆?？梢酝ㄟ^細胞培養(yǎng)和病毒擴增過程進行大規(guī)模生產。

4.細胞轉染：將目標哺乳動物細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，然后將病毒顆粒加入培養(yǎng)基中與細胞進行共培養(yǎng)。病毒顆粒會與細胞表面的受體結合，并進入細胞內部。

5.核酸導入和表達：一旦病毒進入細胞內部，它會釋放出核酸負鏈，該負鏈會被細胞核內的轉錄和翻譯機制利用。目標核酸的表達產物（例如蛋白質）會在細胞內合成，并根據(jù)實驗需要發(fā)揮其功能。

6.實驗分析：根據(jù)實驗目的，可以對細胞和表達產物進行進一步的分析。這可能包括檢測蛋白質表達水平、功能研究、細胞行為觀察等。

操作步驟

A 慢病毒制備：

1、提前一周復蘇293T細胞，使用10% FBS-DMEM培養(yǎng)基傳代3次以上。

轉染前一天將生長狀態(tài)良好的293T細胞用0.25%胰酶消化，得到細胞懸液，計數(shù)，然后進行慢病毒質粒轉染，稀釋到10個/mL；

將293T接種到6孔板（每孔接種2 mL），使其密度為40%。

待其生長到孔板面積80-90%進行轉染。

2、通過質粒大提獲得無內毒素質粒。

3、在1.5mLEP管中分別加入150μL DMEM培養(yǎng)基、15μL lipofectamine 2000。

4、在1.5 mL EP 管中分別加入700μL DMEM培養(yǎng)基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG（使三條質粒質量比為 4:3:1）。

5、將等體積的質?；旌衔锛尤氲睫D染試劑混合物中，室溫靜置5min。

6、將隔夜培養(yǎng)的6孔板中培養(yǎng)基小心吸出，替換為新鮮DMEM（血清）細胞培養(yǎng)基。每個孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000復合物。

7、分別在轉染后24h、48h，收集六孔板中病毒上清液，經0.45μm的濾膜過濾或離心去除細胞碎片（短期內可放于4℃保存，長期保存于-80℃冰箱，勿反復凍融）。

B 慢病毒感染：

1、提前一周復蘇靶細胞，傳代三次以上保證細胞生長狀態(tài)良好。病毒感染前一天將靶細胞傳代到6孔板，使細胞生長密度為約20%。

2、待細胞生長至孔板面積50-60%時，加入2ml病毒液，加入polybrene,并補加0.5ml（血清）細胞培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)24h。

3、用（血清）細胞培養(yǎng)基更換病毒液，恒溫培養(yǎng)24h。

4、加入適量的抗生素篩選，每次換液時補加抗生素，至靶細胞細胞無明顯死亡。

注意事項：

1.選擇合適的載體和元件：根據(jù)實驗需要選擇適當?shù)馁|粒載體和啟動子，例如CMV啟動子、SV40啟動子等。

2. 細胞狀態(tài)和轉染密度：細胞狀態(tài)好，且處于指數(shù)生長階段。靶細胞密度不宜過高或過低，建議將細胞密度控制在指數(shù)期的70-80%；

3. 選擇合適轉染試劑、比例和轉染時間：選擇適當?shù)霓D染試劑，不同類型的細胞和外源DNA可能需要使用不同的試劑進行轉染；

同時，還需要對慢病毒質粒、DNA和轉染試劑的比例、轉染時間進行優(yōu)化?？稍诟腥景屑毎麜r加入適量的聚凝胺提高轉染效率。

4.抗生素濃度：可在轉染前做MTT實驗探究其工作濃度，選取合適的篩選濃度使轉染的細胞能夠存活并形成穩(wěn)定的細胞系。

5.篩選時間：在進行穩(wěn)定轉染實驗時，需要進行足夠長的篩選時間以檢測出穩(wěn)定轉染的細胞系，轉染后可通過WB，流式細胞術，Dot blot等方法驗證。

6．對照組設置：設置陽性和陰性對照以評估轉染效果和篩選是否成功。

以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術與產品資訊。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩(wěn)定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產品和物流服務。 專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持，隨時為客戶提供服務。